Priony w drożdżach

21 października 2014

W ostatnich latach, zarówno w świecie nauki, jak i w mediach, coraz częściej mówi się o prionach, które są przyczyną np. choroby Kreutzfeldta-Jakoba. Rzadko jednak mówi się o innych właściwościach prionów, a mało kto wie, że priony występują również w grzybach, np. w drożdżach piekarniczych Saccharomyces cerevisiae, które są szeroko wykorzystywane w przemyśle spożywczym i w naszych domach.

Część II

Priony w drożdżach

W ostatnich latach badania prionów występujących w drożdżach piekarniczych Saccharomyces cerevisiae także przyniosły wiele nowych informacji. Przy rozważaniach tego problemu koniecznie trzeba podkreślić, że priony drożdżowe nie mają żadnego związku z prionami występującymi u ssaków i nie powodują żadnych chorób. Nazwa ta nawiązuje jedynie do ich wspólnej cechy, jaką jest możliwość przyjmowania dwóch różnych konformacji bez zmiany sekwencji aminokwasowej oraz odkładanie się, w pewnych warunkach, w postaci złogów β-amyloidowych. Oczywiście priony drożdżowe nie pozostają obojętne dla komórki, istotnie, powodują rozmaite zmiany fenotypu, ale tylko u drożdży.

schemat bialka sup35

Ryc. 7 Schemat związku białka Sup35 z czynnikiem [PSI+]. Zaadaptowano z Uptain i Lindquist, 2002

Jednym z najlepiej poznanych prionów drożdżowych jest czynnik [PSI+] (Cox i in., 1988). Drożdże zainfekowane tym prionem dużo częściej pomijają kodony stop występujące na końcu obszaru kodującego genu, często więc w tych komórkach występują dłuższe cząsteczki mRNA, a przez to również dłuższe białka, mające dodatkowe aminokwasy na C-końcu łańcucha polipeptydowego. Intensywne badania wykazały, że istotą czynnika [PSI+] jest białko Sup35 (Wickner, 1994). Białko to jest składnikiem złożonego kompleksu uwalniającego rybosom w odpowiednim momencie (Stansfield i in., 1995). Gdy białko Sup35 nie jest w stanie działać poprawnie, kompleks ten nie może w odpowiednim momencie odłączyć rybosomu od mRNA, co skutkuje powstawaniem dłuższego łańcucha polipeptydowego. Drożdże wykazujące taką cechę oznacza się symbolem [PSI+], natomiast komórki nie wykazujące żadnych zmian są oznaczane symbolem [psi-] (Ryc. 7).

Badanie czynnika [PSI+] znacznie ułatwiła dobrze poznana mutacja w genie ADE2, który koduje jeden z enzymów niezbędnych do biosyntezy adeniny. Mutacja ta wprowadza przedwcześnie kodon stop w genie ADE2 i uniemożliwia powstawanie enzymu o pełnej długości. Taki enzym nie jest w stanie uczestniczyć w biosyntezie adeniny i powoduje nagromadzenie się półproduktu, który – szczęsliwie dla badaczy – ma barwę czerwoną (Silhankova, 1972). Naukowcy przeprowadzili doświadczenie polegające na wprowadzeniu czynnika [PSI+] do komórek, które miały wcześniej opisaną mutację w genie ADE2. Zgodnie z przewidywaniami okazało się, że takie drożdże, w przeciwieństwie do komórek [psi-], miały normalny kolor (Cox i in., 1980). Tłumaczy się to tym, że czynnik [PSI+] spowodował pominięcie przedwczesnego kodonu stop (mutacji w genie ADE2) i doprowadził do powstania funkcjonalnych cząsteczek enzymu potrzebnego do biosyntezy adeniny – nie akumulował się więc czerwony barwnik (Ryc. 8).

Ryc. 8 Prorównanie drożdży [psi-] i [PSI+]. Mutacja w genie ADE2 w drożdżach [psi-] powoduje u nich akumulację czerwonego barwnika. Fenotyp [PSI+] powodujący pomijanie kodonów stop przywraca normalny wygląd kolonii drożdży.

Białko Sup35 składa się zasadniczo z trzech domen N, M i C (Ryc. 9). Domena C jest właściwą częścią białka, która ma aktywność uwalniania rybosomów i wykazano, że białko pozbawione domen N i M jest w stanie pełnić swoją funkcję w komórce bez żadnych problemów. Domena N jest natomiast częścią, która nie pełni żadnej roli w kontekście właściwej funkcji białka Sup35, jednak to właśnie ta część jest odpowiedzialna za to, że białko Sup35 wykazuje charakter białka prionowego (Derkatch i in., 1999). Rejon ten zawiera bardzo dużo aminokwasów z polarnymi grupami bocznymi (Derkatch i in., 2004), co wydaje się cechą charakterystyczną drożdżowych białek prionowych. Wniosek ten wynika z porównań kilku białek prionowych występujących w różnych gatunkach grzybów, m.in. w drożdżach piekarniczych.

Ryc. 9 Schematyczna organizacja domen białka Sup35.

Aby potwierdzić rolę domeny N w powstawaniu formy prionowej białka Sup35, badacze przeprowadzili doświadczenie, którego celem było przeprowadzenie wytypowanego białka w stan prionu, czyli zmiana jego struktury przestrzennej bez zmiany sekwencji aminokwasowej (Li i Lindquist, 2000). Do tego doświaczenia wybrano wariant receptora glukokortykoidów występującego u szczurów, będącego jednocześnie czynnikiem transkrypcyjnym aktywnym konstytutywnie, oznaczony symbolem GR526. Białko to aktywuje transkrypcję genów, które są pod kontrolą sekwencji nukleotydowej GRE. Warto podkreślić, że celowo wybrano białko nie występujące w drożdżach, by zwiększyć wiarygodność wyników. Badacze skonstruowali sztuczny gen będący fuzją fragmentu genu SUP35 kodującego domenę N i M oraz genu kodującego GR526. Produktem takiego sztucznego genu jest białko, które ma domeny N i M z białka Sup35 oraz GR526 (zamiast domeny C białka Sup35). Jeśli rzeczywiście domena N jest odpowiedzialna za zmianę konformacji białka, można było spodziewać się, że GR526 na skutek zmiany kształtu straci funkcję czynnika transkrypcyjnego. W celu wykrycia tego zjawiska, badacze stworzyli jeszcze jedną konstrukcję, która polegała na podłączeniu sekwencji nukleotydowej GRE z genem lacZ kodującym β-galaktozydazę. Drożdże do których wprowadzony został ten układ doświadczalny wysiano na pożywkę zawierającą bezbarwny substrat dla β-galaktozydazy, który jednak pod wpływem działania tego enzymu staje się niebieski. Obecność białych kolonii potwierdzałaby rolę domeny N, jako tej odpowiedzialnej za powstawanie form prionowych drożdżowych białek, m.in. białka Sup35 (Ryc. 10).
 

Ryc. 10 Schemat sztucznego białka (domena N i M z białka Sup35 oraz GR526), alternatywne ścieżki tego białka (utrata funkcji lub wiązanie się z GRE i powstanie β-galaktozydazy z genu lacZ) oraz zdjęcie szalek ze spontanicznie pojawiającymi się koloniami drożdży o innym zabarwieniu. Dokładne objaśnienia w tekscie.

Rzeczywiście na tle niebieskich kolonii zaobserwowano białe kolonie. Interesująca jednak była dalsza część doświadczenia. Po przeszczepieniu białych kolonii na nową pożywkę zaobserwowano spontanicznie pojawiające się niebieskie kolonie drożdży. Tłumaczy się to tym, że priony mogą spontanicznie zmieniać swój stan konformacji. Wydaje się, że bałka z tej grupy, mogą więc przechodzic pomiędzy stanem normalnym a pionowym bez bodźców zewnętrznych. Ostatnie badania wskazują, że częstość spontanicznej zmiany konformacji białek takich jak białko Sup35 wynosi od 10-5 do 10-7. Oczywiście są czynniki zwiększające tę częstość, tj. podwyższenie temperatury, dodanie lizatu komórek [PSI+], dodanie domeny N oraz liczne mutacje (Uptain i Lindquist, 2002).

Gdy weźmie się pod uwagę skutki obecności czynnika [PSI+], raczej nie wydaje się, by było to korzystne dla komórki. Jednak dla drożdży z wieloma mutacjami typu nonsense posiadanie prionu [PSI+] może okazać się ostatnią i jedyną deską ratunku. Dla tych drożdży pomijanie większości kodonów stop (nawet tych występujących w odpowiednim miejscu) jest bardziej korzystne niż zatrzymywanie syntezy białek przedwcześnie (True i Lindquist, 2000). Jest to hipoteza, która częściowo może tłumaczyć obecność prionu [PSI+] w drożdżach, choć raczej trudno jest sobie wyobrazić podobne wytłumaczenie dla obecności prionów u ssaków.

Prion [PSI+] ma także znaczenie w różnorodności fenotypu. Różnice między szczepami [psi-] i [PSI+] stają się szczególnie wyraźne w trudnych warunkach środowiska, a różnorodność fenotypu spowodowana posiadaniem czynnika [PSI+] można uznać za etap poprzedzający zwiększenie różnorodności genotypu. Konkretnym przykładem są badania wzrostu drożdży wykonane na pożywkach z dodatkiem bleomycyny, anisomycyny lub benomylu – są to związki wykorzystywane m.in. w terapii nowotworów (True i Lindquist, 2000; True i in., 2004). Okazało się, że na pożywce z dodatkiem bleomycyny i anisomycyny zwykłe drożdże nie są w stanie rosnąć, podczas gdy komórki z czynnikiem [PSI+] radziły sobie bardzo dobrze. Natomiast w przypadku dodania benomylu do pożywki sytuacja była już inna. W tym przypadku komórki [psi-] dawały sobie dużo lepiej radę niż komórki z czynnikem [PSI+]. Ilustruje to bardzo dobrze naturę tego prionu. Są pewne sytuacje, gdy jego obecność umożliwia przeżycie komórki, jednak trudno jest przewidzieć jakie to są warunki, zwłaszcza, że są warunki, w których posiadanie czynnika [PSI+] wręcz uniemożliwia przeżycie.
psi i ewolucja drozdzy

Ryc. 11 Znaczenie czynnika [PSI+] w ewolucji drożdży. Koła symbolizują komórki drożdży, pola zaś środowiska. Dla drożdży oznaczonch kolorem granatowym optymalne jest środowisko oznaczone kolorem niebieskim. Drożdże oznaczone kolorem czerwonym charakteryzują się najlepszym dostosowaniem do środowiska oznaczonego kolorem pomarańczowym. Dokładne objaśnienia w tekscie.

W ostatnich latach postulowana jest również hipoteza zakładająca związek między czynnikiem [PSI+] i ewolucją genomu drożdży (True i in., 2004). Jak wcześniej wspomniano, z pewną częstością w sposób spontaniczny budowa przestrzenna białka Sup35 może się zmieniać. Normalnie funkcjonujące białko może przyjąć konformację charakterystyczną dla formy prionu. W zwykłych warunkach środowiska, zmiana ta nie przynosi komórce żadnych korzyści. Jednak nagła zmiana warunków środowiska może spowodować, że jedyną możliwością przeżycia staje się posiadanie czynnika [PSI+]. W takich warunkach faworyzowane są komórki [PSI+] i zaczynają one dominować w populacji. Wraz ze wzrostem liczby komórek, spontanicznie zaczynają się pojawiać komórki [psi-]. Nie są one faworyzowane w tych warunkach środowiska, jednak jeśli nastąpi nagły powrót warunków środowiska do pierwotnych, komórki pozbawione czynnika [PSI+] stają się znów lepiej przystosowanymi do otaczających warunków. Oczywiście w takiej sytuacji komórki [PSI+] przechodzą do mniejszości (Ryc. 11).

Wyżej opisany mechanizm umożliwia komórkom drożdży szybkie dostosowanie się do panujących warunków środowiska. W przeciwieństwie do zmian genetycznych, przejście ze stanu [psi-] do stanu [PSI+] nie zajmuje dużo czasu, ponadto pozwala w razie potrzeby powrócić do poprzedniego stanu. Można z pewnością stwierdzić, że ten mechanizm dostosowania fenotypu do warunków środowiska pozwala komórkom drożdży zminimalizować nie tylko ryzyko, ale także koszty związane z ewolucją.

drozdze

Ryc. 12 Drożdże wykorzystywane w badaniach nad lekami przeciwprionowymi. Powierzchnię pożywki w szalce petriego pokrywa się w całości drożdżami z mutacją w genie ADE2 (p. ryc. 8) wykazującymi fenotyp [PSI+]. Następnie kładzie się krążki bibułowe nasycone badanymi związkami chemicznymi (potencjalnymi lekami). Krążki, wokół których pojawia się czerwone zabarwienie są nasycone związkami powodującymi zmianę konformacji białka Sup35 (utrata zdolności pomijania kodonu stop w genie ADE2, przywrócenie normalnej budowy białka Sup35). Związki te następnie badane są pod względem zdolności przywracania poprawnej konformacji białka PrP u ssaków. Zaadaptowano z Saupe, 2003

Ostatnie lata pozwoliły przeprowadzić syntezę badań prowadzonych nad prionami u ssaków i u drożdży. Od dłuższego czasu odkrywane są różne związki chemiczne, które wydają się hamować rozwój chorób prionowych u ssaków, a przede wszystkim u ludzi. Jednak badania na dużą skalę są trudne z powodów bezpieczeństwa. Po lepszym poznaniu właściwości prionów drożdżowych, badacze zaczynają wykorzystywać drożdże do wstępnej oceny właściwości leczniczych różnych związków chemicznych, dopuszczając jedynie te najbardziej obiecujące do badań klinicznych (Saupe, 2003). Jedną ze strategii leczenia chorób prionowych jest przywrócenie pierwotnej budowy przestrzennej białka PrP. Ponieważ geneza prionów drożdżowych jest zbliżona do ssaczych, ocenia się zdolność poszczególnych związków chemicznych pod kątem przywracania pierwotnej struktury białka Sup35, czyli zmiany komórek [PSI+] w komórki [psi-] (Ryc. 12). Poza względami etycznymi ważnym aspektem wykorzystywania drożdży do badań są kwestie finansowe. Pierwszymi związkami przebadanymi w ten sposób i dopuszczonymi do dalszych etapów badań są chloropromazyna i chinakryna (Saupe, 2003), choć najnowsze doniesienia wskazują niestety na brak aktywności terapeutycznej obu związków chemicznych (Benito-Leon, 2004; Caramelli i in., 2006). Są również próby wykorzystanie specyficznych przeciwciał wiążących jedynie PrPSc (opłaszczając chorobotwórczą formę białka i uniemożliwiając jej polimeryzację i odkładanie się w formie złogów β-amyloidowych) lub PrPC (chroniąc fizjologiczną formę białka, by nie mogła się przekształcać w formę chorobotwórczą), żadna metoda leczenia jednak nie została do tej pory uznana za odpowiednio skuteczną, by dopuścić do leczenia pacjentów na szeroką skalę (Saupe, 2003)

Podsumowanie

Zmiana fenotypu związana z prionami coraz częściej uznawana jest za formę informacji genetycznej, choć nie pośredniczą w jej przekazywaniu kwasy nukleinowe – z tego punktu widzenia niektórzy badacze zaliczają ją do zjawiska epigenetycznego (True i in., 2004), podobnie jak kod histonowy (modyfikacje posttranslacyjne histonów powodujących rozmaite zmiany nie Ryc. 12 Drożdże wykorzystywane w badaniach nad lekami przeciwprionowymi. Powierzchnię pożywki w szalce petriego pokrywa się w całości drożdżami z mutacją w genie ADE2 (p. ryc. 8) wykazującymi fenotyp [PSI+]. Następnie kładzie się krążki bibułowe nasycone badanymi związkami chemicznymi (potencjalnymi lekami). Krążki, wokół których pojawia się czerwone zabarwienie są nasycone związkami powodującymi zmianę konformacji białka Sup35 (utrata zdolności pomijania kodonu stop w genie ADE2, przywrócenie normalnej budowy białka Sup35). Związki te następnie badane są pod względem zdolności przywracania poprawnej konformacji białka PrP u ssaków. Zaadaptowano z Saupe, 2003 tylko w stanie chromatyny, a także komórki; Jenuwein i Allis, 2001). Problemy związane z prionami są intensywnie badane zarówno z powodu chorób, na które cierpi wielu ludzi, a także zwierząt mających ogromne znaczenie gospodarcze, jak również z powodu czysto naukowego. Badania te mogą przecież przyczynić się do poznania mechanizmów jednego z najbardziej tajemniczych zjawisk współczesnej biologii. Badania te z całą pewnością pozwolą także wzbogacić wiedzę na temat związku sekwencji aminokwasowej i budowy przestrzennej białek – intensywnie badanego problemu, który łączy wiele dyscyplin naukowych.
 

Autor: Takao Ishikawa

Literatura:
Benito-Leon J (2004) Clin Neuropharmacol. 27(4): 201-203
Caramelli M, Ru G, Acutis P, Forloni G (2006) CNS Drugs 20(1): 15-28
Cox BS, Tuite MF, McLaughin CS (1988) Yeast 4: 159-178
Cox BS, Tuite MF, Mundy CJ (1980) Genetics 95(3): 589-609
Dealler S, Lacey R (1991) Nutr Health 7(3): 117-133
Derkatch IL, Bradley ME, Zhou P, Liebman SW (1999) Curr Genet. 35(2): 59-67
Derkatch IL, Uptain SM, Outeiro TF, Krishnan R, Lindquist SL, Liebman SW (2004) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 101(35): 12934-12939
Hegde RS, Rane NS (2003) Trends Neurosci. 26(7): 337-339
Jackson GS, Clarke AR (2000) Curr Opin Struct Biol. 10(1): 69-74
Jenuwein T, Allis CD (2001) Science 293(5532): 1074-1080
Li L, Lindquist SL (2000) Science 287(5453): 661-664
Moore RA, Vorberg I, Priola SA (2005) Arch Virol Suppl. 19: 187-202
Prusiner SB (1982) Science 216: 136-144
Prusiner SB (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13363-13383
Prusiner SB, Scott MR, DeArmond SJ, Cohen FE (1998) Cell 93: 337-348
Rachidi W, Vilette D, Guiraud P, Arlotto M, Riondel J, Laude H, Lehmann S, Favier A
(2003) J Biol Chem. 278: 9064-9072
Saupe SJ (2003) Trends in Biotech. 21(12): 516-519
Silhankova L (1972) Folia Microbiol (Praha) 17(6): 479-489

Materiały o podobnej tematyce